A、間接氣相色譜法
國內普遍采用的是在堿性條件下，以三乙胺為酯化劑，和靛紅酸酐進行酯化反應，利用氣相色譜進行內標法定量。由于靛紅酸酐受熱容易分解，不能直接進行氣相色譜分析，需對其先進行酯化。
一、儀器和試劑
1.儀器
SC-石型氣相色譜儀(四川分析儀器廠)
CR-3A色譜處理機(日本)
1S0C一100 恒溫電磁攪拌器(上海有機所開發公司)
10微升微量注射器
攪拌子(自制, 外為玻璃細管密封, 內含鐵絲)
2. 試劑和樣品
無水乙醇(分析純)三乙胺( 分析純)靛紅酸醉標樣, 純度為99 % (瑞爾豐化工提供)
鄰氨基苯甲酸乙醋, 純度為99% (瑞爾豐化工提供)
內標物, 鄰苯二甲酸二甲醋( 色譜純)
二、色譜條件
1.色譜柱: 2 米x 3 毫米不銹鋼柱, 內裝2%OV-17chromsorb WAW一DMCS(60一80目) 擔體(日本)
2. 溫度及氣體流速
柱溫17 2℃；
汽化溫度230 ℃；
檢測溫度230 ℃；
載氣(NZ),30 毫升/分；
燃氣(H2),35毫升/分；
空氣: 30毫升/ 分。
3.靈敏度及衰減: 10 x l/2
4. 紙速: 2 毫米/分
三、衍生化反應條件
靛紅酸醉: 內標: 無水乙醇: 三乙胺=70毫克: 70毫克: 3毫升: 0.3毫升
水浴溫度: 6 0 ℃ 一7 0 ℃
磁力攪拌反應時間: 大于10分鐘
在上述色譜條件和衍生化條件下, 樣品、內標和雜質均得到很好分離, 峰形對稱。
四、定量分析
1. 反應轉化率測定
稱取純品鄰氨基苯甲酸乙醋0.070克和內標物0.070 克于15毫升磨口瓶中, 加5毫升無水乙醇, 搖勻, 在前述色譜條件下進樣分析。測得鄰氨基苯甲酸乙醋的相對校正因子f 值。
稱取靛紅酸醉標樣0.070克和內標物0.070 克于15 毫升具塞磨口瓶中, 加3 毫升無水乙醇，0.3毫升三乙胺, 放人攪拌子, 調節好水浴溫度, 即在前述的衍生化條件下進行醋化反應。反應完成后再加人適量無水乙醇, 搖勻后, 進針分析。測得一個相當于靛紅酸醉對內標的相對校正因子f'。
2.樣品測定
稱取0.075克樣品和0.070 克內標于15毫升具塞磨口瓶中, 加3 毫升無水乙醇,0.3 毫升三乙胺及攪拌子, 在前述衍生化條件下進行酷化反應。反應完成后再加人適量無水乙醇稀釋, 搖勻后, 在前述色譜條件下按如下順序進樣分析: 標準溶液(靛紅酸醉標液或鄰氨基苯甲酸乙醋標液)、樣品溶液、標準溶液、樣品溶液。
B、直接液譜法
1 儀器與試劑高效液相色譜儀： 美國戴安公司PDA100，具可變波長紫外檢測器； 色譜工作站； 色譜柱： 250mm×4.6mm （i.d.） 不銹鋼柱，Kromasil C18 （ 5μm） ； 過濾器： 濾膜孔徑約0.45μm； 定量進樣閥： 20μL； 甲醇（色譜純）；去離子水； 冰乙酸（分析純）； 靛紅酸酐標樣（質量分數≥98%）。
2 操作條件流動相： 甲醇+水+冰乙酸=40+60+0.5 （V/V） ； 流速： 1mL/min； 柱溫： 20℃；進樣量： 20μL； 檢測波長： 220nm； 保留時間：靛紅酸酐約9.2min。
3 測定步驟
3.1 標樣溶液的配制稱取靛紅酸酐標樣
0.05g （精確至0.000 2g），置于100mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲10min，冷卻至室溫后作為母液，用移液管移取10mL母液至50mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，用微孔濾膜過濾，濾液待測。
3.2 試樣溶液的配制稱取試樣0.05g （精確至0.000 2g），置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用流動相定容至刻度，超聲10min，冷卻至室溫后用移液管移取10mL至50mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，用微孔濾膜過濾，濾液待測。
3.3 測定在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針相對響應值變化<1.5%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。
4 計算
將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中靛紅酸酐峰面積分別進行平均。
5結果與討論
5.1 流動相的選擇因靛紅酸酐易水解，故在流動相中加入冰乙酸，調節流動相的pH值=4.0，抑制其水解。因靛紅酸酐的主要干擾雜質為原料鄰苯二甲酰亞胺，故使用甲醇+水+冰乙酸=40+60+0.5 （V/V），有效分離干擾物。
5.2 檢測波長的選擇利用二極管陣列檢測器對靛紅酸酐進行掃描得出，靛紅酸酐在220nm及260nm處（圖3） 有最大吸收峰，考慮到分離好、且無雜質干擾，故選用220nm作為檢測波長。
5.3 方法的精密度測定按上述處理方法，同樣的儀器條件，稱取同一樣品，進行5次平行測定，計算標準偏差和變異系數，結果統計靛紅酸酐的標準偏差為0.02，變異系數為0.12。
5.4 線性相關性的測定從2.3.1標樣母液中分別用移液管移取5、7.5、10、12.5、15mL至5個50mL容量瓶中，配制5個不同濃度（以x表示） 的靛紅酸酐溶液，在前述操作條件下進行檢測，測定靛紅酸酐的峰面積y （表3），以標準溶液濃度x為橫坐標，以峰面積y為縱坐標，進行線性相關分析。靛紅酸酐的線性方程為y = 2 585.8x-8.122 5，R2 =0.999 7，相關系數r=0.9998，線性相關圖。