動物源性食品中磺胺二甲嘧啶 ELISA 試劑盒
1 范圍
本標準規定了磺胺二甲嘧啶（SM2）試劑盒產品的構成、技術要求、試驗方法、檢驗規則及標志、包裝、運輸、貯存。
本標準適用于采用動物源性食品中磺胺二甲嘧啶酶聯法快速檢出方法的磺胺二甲嘧啶ELISA試劑盒（以下簡稱產品)，適用于動物源性食品中磺胺二甲嘧啶ELISA試劑盒快速半定量檢測。
2 規范性引用文件
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GB/T 191 包裝儲運圖示標志
農業部 1025 號公告-24-2008 動物源食品中磺胺二甲嘧啶殘留檢測 酶聯免疫吸附法
JJF 1070 定量包裝商品凈含量計量檢驗規則
國家質檢總局第75號令《定量包裝商品計量監督管理辦法》
3 產品構成及規格
3.1 產品構成
產品主要包括檢測酶標板（鋁箔袋密封包裝）、標準品六瓶（0 ng/ml、0.5 ng/ml、1.5 ng/ml、4.5 ng/ml、13.5 ng/ml、54 ng/ml）、10×濃縮酶結合物、10×濃縮洗滌液、酶結合物稀釋液、顯色劑 A、顯色劑 B、終止液、蓋板膜、說明書。其他相關試劑和設備不提供。
3.2 規格
應符合表1規定。
表1 規格
組成部分 規格
檢測酶標板 96 孔酶標板 1 塊
標準品六瓶 1ml/瓶
10×濃縮酶結合物 1.2 ml
10×濃縮洗滌液 50 ml
酶結合物稀釋液 20 ml
顯色劑 A 7 ml
顯色劑 B 7 ml
終止液 7 ml
蓋板膜 2 張
說明書 1 份
3.3 外觀
應符合表2要求。
表2 外觀
項目 要求
檢測酶標板 試劑瓶 蓋板膜
外觀 密封包裝 無破損,密封無泄漏 無破損
4 技術要求
4.1 技術原理
本試劑盒是利用免疫學競爭法的原理，在酶標板微孔上預包被抗磺胺二甲嘧啶抗體。檢測時，加入標準品或樣品溶液及 SM2 酶結合物，他們競爭性地與 SM2 抗體結合，形成抗原抗體復合物；用 TMB底物顯色；加入反應終止液后在 450nm 波長酶標儀下進行檢測，樣品中的 SM2 濃度與吸收光強度成反比。
4.2 靈敏度
本試劑盒靈敏度為0.5 ng/ml。
4.3 檢出限
高檢測限：肌肉、肝臟、腎臟等組織最低檢出限為 2 ng/ml，尿液最低檢出限為 5 ng/ml，飼料最低檢出限為 5 ng/ml，蜂蜜最低檢出限位 5 ng/ml；
低檢測限：肌肉、肝臟、腎臟等組織最低檢出限為 10 ng/ml，尿液最低檢出限為 10 ng/ml。
準確度
尿液添加回收率 90-115%，肌肉添加回收率 75-100%，肝樣添加回收率 90-115%，蜂蜜添加回收率 100-115%，飼料添加回收率 75-100%。
4.4 精密度
根據SN/T0001-1995中規定，批內變異系數在小于10%，批間變異系數小于10%。
4.5 凈含量偏差
凈含量偏差應符合《定量包裝商品計量管理辦法》要求。
5 試驗方法
5.1 試驗條件
試驗溫度：15℃～30℃。
5.2 外觀檢查
目測無破損。
5.3 檢出限的檢測
5.3.1 制樣
臨用前純水把磺胺二甲嘧啶標準液稀釋至100 ng/ml做添加用。添加磺胺二甲嘧啶的濃度為0 ng/g，5 ng/g，10 ng/g。
5.3.2 提取
5.3.2.1樣本前處理需配置：
配液 1：配液 1：3%三氯乙酸
量取 3g 三氯乙酸加蒸餾水定容至 100mL
配液 2：1M 碳酸鈉
稱取 10.6g 碳酸鈉加蒸餾水溶解定容至 100mL
配液 3：0.2MPBS
稱取 1.65g 二水磷酸二氫鈉，67.83g 十二水磷酸氫二鈉和 8.766 g 氯化鈉加蒸餾水溶解定容至 1000mL
配液 4：1M 氫氧化鈉（用于蜂蜜樣品）
稱取 4g 氫氧化鈉加蒸餾水定容至 100mL
配液 5：0.1M 磷酸氫二鉀（用于蜂蜜樣品）
稱取 22.8g 三水磷酸氫二鉀加蒸餾水溶解定容至 1L
配液 6：1M 鹽酸（用于蜂蜜樣品）
量取 8.6mL 濃鹽酸加蒸餾水定容至 100mL
5.3.2.2 低檢測限樣本提取
A、尿液
取1mL尿液，加入1mL蒸餾水，充分混合，取20μL進行分析。
B、豬肉、豬肝、飼料等
（1）稱取2±0.05g勻漿組織于15mL離心管中，加入6ml 3%三氯乙酸，振蕩10min，4000r/min離心5min；
（2）取1mL上清至1.5mL離心管中，加入40μL 1M Na2CO3，調pH值至中性，取20μL進行分析。
5.3.2.3 高檢測限樣本提取
A、尿液
取2mL尿液，加入8mL乙酸乙酯，震蕩萃取10min，3000轉以上離心10min，取上層液4mL，于60℃水浴條件下氮氣吹干，加2mL0.2M PBS（配液3）溶解殘留，取20μL進行分析。
B、豬肉、豬肝、飼料等
（1）稱取2±0.05g勻漿組織于15mL離心管中，加入8mL乙腈混合，振蕩20min，4000r/min離心5min；
（2）取2mL上清至另一15mL離心管中，60℃水浴條件下氮氣吹干；
（3）加入1mL正己烷，用渦旋儀渦動20S溶解干燥的殘留物，再加入1mL0.2M PBS（配液3）渦旋1min，4000r/min離心5min，除去上層正己烷相；
（4）取20μL水相進行分析。
C、蜂蜜
（1）取0.8g蜂蜜，放入15mL離心管中，加入3.2mL水和0.32mL1M NaOH(配液4)，混勻，加入4mL乙酸乙酯，劇烈振蕩，室溫4000r/min離心5min；
（2）棄去上層3mL，再加4mL 0.1M K2HPO4 (配液5) ，0.4 mL 1M HCl（配液6），混勻，加入3mL乙酸乙酯，劇烈振蕩5min，室溫4000r/min離心5min；
（3）移取2mL上層乙酸乙酯（相當于0.4g樣品）到另一離心管中，60℃水浴條件下氮氣吹干；
（4）用正己烷0.8mL溶解干燥的殘留物，加入0.2MPBS（配液3）0.8mL，振蕩2min，室溫4000r/min離心5min，除去上層正己烷相；
（5）取20μL水相進行分析。
5.3.3 ELISA 檢測
5.3.3.1 測定前須知：
（1）使用之前，將所用試劑和需用微孔板回升至室溫。
（2）使用之后，立即將所有試劑放回 2~8℃。
（3）在使用中，不要讓微孔干燥。
（4）ELISA 分析中的重復性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的關鍵。
（5）在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
5.3.3.2 測定步驟：
（1）將所需試劑從冷藏環境中取出，在室溫下平衡 30min 以上，每種液體使用前均須搖勻，注意標準品均需做 2 個平行試驗。
（2）配液：
配液 A：洗滌工作液
將 50mL10×濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋至 500mL 備用。（可按需配制）
配液 B：酶結合物工作液
將酶稀釋液將 10×濃縮酶結合物稀釋 10 倍（如取 0.1mL 10×濃縮酶結合物+0.9mL 酶稀釋液（臨用時按需配制）
（3）加標準品或樣品液 20μL 到相應的微孔中，然后加 80μL 酶結合物工作液（即配液 B）到微孔中用蓋板膜蓋好，26℃下避光反應 30min；
（4）小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗滌工作液（即配液 A）300μL/孔，充分洗滌 4~5 次，每次間隔 10s，在吸水紙上拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的吸頭戳破）；
（5）顯色劑 A 和 B 以 1：1 充分混合后，加 100μL 到微孔中，并在 26℃下避光反應 15min；
（6）加 50μL 終止液到微孔中，用酶標儀于 450nm 處測定 OD 值。
5.3.4 結果計算
所測得的標準品和樣品吸光度的平均值除以第一個標準品（0 標準品）的吸光度值，再乘以 100（0標準品的百分吸光度值等于 100%），得到百分吸光度值。如下式：
標準品（或樣品）的吸光度值
吸光度值 %=--------------------------------------------------×100
0準品的吸光度值
以標準品濃度的常用對數（10 為底）為橫坐標 X 軸，百分吸光度值為縱坐標 Y 軸，繪制標準曲線。
將樣本的百分吸光度值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，以此值作為 10 的冪，乘以稀釋倍數，即為樣品中所含磺胺二甲嘧啶的量。
5.3.5 注意事項
（1）室溫低于 20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25℃），會導致所有標準的 OD 值偏低。
（2）在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象，所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
（3）每加一種試劑前需要將其搖勻。
（4）反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚，如不慎滴漏到皮膚上，請盡快用水沖洗。
（5）不要使用過了有效期的試劑盒，也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
（6）儲存條件：保存試劑盒于 2~8℃，不要冷凍，將不用的微孔板用蓋板膜蓋好后放進自封袋中重新密封，標準物質和無色的顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
（7）試劑變質的跡象：顯色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之，0 標準品的吸光度（450nm）值小于 0.6（A450nm<0.6）時，表示試劑可能變質。
（8）在加入顯色劑后，一般顯色 15min 即可，若顏色較淺，可延長反應時間到 20min（或更長），但不得超過 30min；反之，則縮短反應時間。
（9）該試劑盒最佳反應溫度為 26℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
5.4 檢出率檢查
按5.3.1的方法制備樣本各2個，采用5.3.2和5.3.3操作步驟平行試驗10孔，計算回收率，符合準確度要求即為合格。
5.5 精密度測定
按5.3.1的方法制備樣本各2個，隨機抽取同一批次的檢測試劑盒6盒，每盒抽取2個板條，采用5.3.2和5.3.3操作步驟分別平行試驗48孔，根據檢測結果計算出批內變異系數；同時隨機抽取3個批次的檢測試劑盒各2盒，每盒抽取2個板條，采用5.3.2和5.3.3操作步驟分別平行試驗48孔，根據檢測結果計算出批間變異系數。
6 檢驗規則
6.1 組批
以同一批次原料、同一班次、同一生產線生產的產品為一批。
6.2 抽樣
從每批中隨機抽取3盒（1盒用于檢驗，1盒用于復檢，1盒用于留樣）。
6.3 檢驗分類
6.3.1 出廠檢驗
產品應由生產企業質量檢驗部門逐批檢驗，合格后方可出廠并附合格證。出廠檢驗項目為外觀、檢
出限。
6.3.2 型式檢驗
有下列情況之一時，應進行型式檢驗
a） 新產品投產時；
b） 停產十二個月以上恢復生產時；
c） 原料、工藝有較大變化時；
d） 正常生產中每十二個月進行一次；
e） 國家質量監督機構提出要求時。
型式檢驗項目為本標準技術要求中的全部項目。
6.4 判定規則
出廠檢驗：如有不合格項時，對不合格項目進行復檢，復檢后仍不合格，則判定該批產品不合格。
型式檢驗：如有不合格項時，對不合格項目進行復檢，復檢后仍不合格，則判定該批產品不合格。
7 標志、包裝、運輸、貯存
7.1 標志
7.1.1 產品外包裝上標志應符合 GB/T 191，并標明下列內容：
a） 企業名稱、產品名稱；
b） 生產日期；
c） 產品批號；
d） 產品標準號；
e） 產品商標。
7.2 包裝
內包裝材料采用鍍鋁鋁箔袋；外包裝采用瓦楞紙盒包裝。
7.3 運輸
產品允許使用一般交通運輸工具，運輸時輕裝輕卸，運輸過程中防止劇烈沖擊、并防潮防曬。
7.4 貯存
產品應貯存于2～8℃密封、干燥、避光存放。
7.5 保質期
產品在上述條件下自生產之日起算保質期為12個月