乙基D環色譜檢測

1、適應性要求
取供試品溶液進樣，檢測波長255nm，理論塔板數按乙基D環色譜峰計算不低于5000，乙基D環色譜峰與相鄰峰的分離度符合要求。

2、溶液的配制
　對照品溶液制備。精密稱取10mg乙基D環對照品于100mL容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，混勻。精密吸取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，該對照溶液濃度為10.0μg/mL。

　供試品溶液的制備。精密稱取10mg供試品于100mL容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，混勻，精密吸取5.0mL該溶液于50mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度。

3、線性范圍
　　精密稱取10mg乙基D環對照品于100mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、15.0mL乙基D環標準溶液于50mL容量瓶中，分別加流動相稀釋至刻度，制成濃度分別為0.002、0.004、0.006、0.010、0.020、0.030μg/mL的1#～6#標準溶液，在2.1.1的色譜系統下，將1#～6#標準溶液分別進樣20μL，計算峰面積。以濃度(c，mg/L)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標作圖，得相關系數及線性回歸方程y=151.11x+8.5201(相關系數r=0.999997)，結果見表1和圖2。結果表明，乙基D環濃度在2.0～30.0mg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

4、最低檢測限
　　分別配制一系列濃度的乙基D環標準溶液，逐步稀釋，在2.1.1的色譜條件下測定，按S/N≥3計算最低檢測限，計算得出最低定量限為0.004μg/mL，檢測限為0.0012μg/mL。

5、穩定性試驗
取同一供試品溶液，室溫下分別于0、1、2、4、8、12h進樣分析，記錄色譜圖，供試品溶液在室溫下避光放置12h內穩定。

6、樣品測定
取乙基D環對照品和原料藥，按1項分別制備對照品溶液和供試品溶液，注入20μL對照溶液于色譜儀中，調節靈敏度至主成分峰高約為滿量程的20%。分別注入對照溶液和供試品溶液各20μL于色譜儀中，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，按外標法以峰面積計算，3批原料藥的含量分別為99.02%、99.14%、98.76%。有關物質線性關系測定精密稱取10mg乙基D環對照品于10mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，精密吸取1.0mL該溶液于100mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，制得乙基D環標準溶液。分別精密吸取1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0mL乙基D環標準溶液于100mL容量瓶中，分別加流動相稀釋至刻度，制成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的1#～6#標準溶液，在上述色譜系統下，將1#～6#標準溶液分別進樣20μL，計算相關系數及線性回歸方程。

7、色譜柱的選擇
　　乙基D環是弱極性化合物，在C8色譜柱上保留時間較短，需通過采用柱長較長的色譜柱及加大溶劑體積比的方法才能延長保留時間，對色譜柱損害較大。本文采用的C18色譜柱，可在較小的溶劑體積比范圍內實現主峰與其他雜質峰的有效分離，延長色譜柱使用壽命。

8、檢測波長的選擇
　　對乙基D環對照品及丁酸和丁二酸分別進行紫外掃描，結果顯示乙基D環的最大吸收波長為255nm，丁酸和丁二酸的最大吸波長均為204nm。由于255nm處丁酸和丁二酸均無吸收，故將丁酸和丁二酸的檢測在204nm波長處，而其他雜質于255nm波長處。

9、流動相的選擇
　　嘗試了不同比例的乙腈磷酸二氫銨-乙腈流動相系統和磷酸二氫鉀-乙腈流動相系統，發現流動相為V(0.02mol/L磷酸二氫鉀)∶V(乙腈)=80∶20時，乙基D環保留時間適宜、峰形良好，且可與各雜質達到有效分離。