原兒茶醛報告

HPLC法測定胎羊血漿中原兒茶醛的濃度

    丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltior. rhiza Bge.)的干燥根及根莖。丹參具有祛瘀止痛，活 血通經，清心除煩的功效。在婦產科方面，丹參制劑 常被用于治療妊娠高血壓綜合征、妊娠肝內膽汁淤積 癥、胎兒窘迫等疾病¨ 。但對于丹參制劑是否會經 母體進入胎兒體內尚不明確。本研究通過測定胎羊血 漿中丹參的有效成分原兒茶醛 ，考察丹參是否能通 過母羊進入胎羊體內，對研究丹參制劑在妊娠期應用 是否安全具有重要的意義。
 1材料

 1.1儀器、藥品和試劑HPI100高效液相色譜儀； 丹參粉針劑，哈爾濱中藥二廠，批號：060904，實驗時 用生理鹽水溶解；原兒茶醛(批號：0810—200004)、卡 馬西平對照品(批號：0412—9503)，中國藥品生物物 制品檢定所；水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑 均為分析純。

 1.2動物健康綿羊(湖羊)8頭，羊齡2～3歲，體重 40～50 kg，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供，實 驗動物生產許可證號：XCYK(蘇)2002—2008。

 2方法與結果

 2.1孕羊的外科手術及標本采集健康綿羊8頭， 于妊娠116～125 d行母羊及宮腔內胎羊外科手術。術前24 h母羊禁食、禁水。術前和術中用氯胺酮和 異氟烷聯合麻醉。母羊仰臥位固定，于下腹近腹中線 分層進腹，探查子宮，了解胎方位，固定胎羊后肢后 切開子宮壁，拉出后肢，于胎羊腹股溝中點偏內側處 分別分離股動脈、股靜脈，遠端結扎，近端插入動靜 脈導管，固定后回納胎羊于宮腔內。縫合子宮壁后并 固定導管，縫合母羊腹壁，各種插管引至母羊背側部 固定。術中母羊頸靜脈插管補液，預防感染。術后 24 h母羊可恢復正常飲食飲水。用滅菌肝素鹽水疏通 導管，分別給母羊靜注慶大霉素72 mg，青霉素1 g 和胎羊靜注慶大霉素8 mg，青霉素33 mg，每日1 次。手術恢復4—5 d后，通過母羊股靜脈分別給予 不同劑量丹參粉針，于給藥不同時間點分別采集胎羊 動脈血，取血分離血漿，于一20℃保存備用。

 2.2色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS柱(250× 4.6 mm，5 Ixm)；流動相由甲醇(A)和0.2 tool-L 的 醋酸銨溶液(硫酸調pH至2.8)(B)組成，進行梯度洗 脫，在0—4 rain，B體積分數為70％，4～12 rain，B 體積分數由70％線性改變至10％，再返回起始流動 相；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL·min ；柱 溫：35℃ 。

 2.3供試品溶液的制備 取血漿樣品250 IxL，加 1 mol·L 鹽酸100 L，酸化，加內標溶液20 L，無水乙醚2 mL渦旋7昆和提取2 min，離心(4000 r· min )10min。分取有機層，40cc水浴上通氮氣揮干。 臨用前殘渣用100 IzL流動相溶解，進樣20 L。

 2.4標準曲線的制備

 2.4.1標準工作液精密稱取原兒茶醛對照品適量， 加1％ 醋酸配成濃度為0.2 mg·mL 的貯備液 ， 4℃保存。臨用前，取原兒茶醛貯備液適量，用1％ 醋酸溶液按倍數稀釋法稀釋至所需濃度。

 2.4.2內標溶液精密稱取卡馬西平適量，用甲醇定 量稀釋配成25 Ixg·mL 的內標溶液。

 2.4.3標準曲線的制備精密吸取不同濃度的原兒茶醛標準工作液5O L，加入空白血漿200 IxL，從“加 1 mol·L 鹽酸100 IxL”起，按“供試品溶液的制 備”方法處理。以原兒茶醛與內標的峰面積比對原兒 茶醛的濃度進行線性回歸，即得標準曲線。

 2.5樣品測定方法精密吸取供試品溶液20 L注入 高效液相色譜儀，記錄原兒茶醛與內標的峰面積，以原兒茶醛與內標的峰面積比為定量指標，根據標準曲 線計算相應的血藥濃度。

 2.6分析方法的評價

 2.6.1特異性在本實驗條件下，原兒茶醛有良好的 分離度，羊血清中雜質峰不干擾樣品峰和內標峰的測 定。原兒茶醛和內標的保留時間分別是4.8 rain和 12.6 min，結果見圖1。

 2.6.2精密度取空白血漿200 L，加入不同濃度 的原兒茶醛標準工作液50 L，制成高、中、低3種 不同濃度樣品，按“供試品溶液的制備”方法處理， “樣品測定方法”測定，考察原兒茶醛的日內、日間 精密度，結果見表1。

 2.6.3線性關系 取空白血漿250 IxL數份，分別加 入不同濃度原兒茶醛標準品，配制成濃度為0.02～ 12.5 g·mL 的標準品系列溶液，按“標準曲線的 制備”方法處理。記錄原兒茶醛峰面積和內標峰面 積， 以樣品峰面積與內標峰面積之比(Y)對原兒茶醛濃度(x)作線性回歸，得回歸方程：Y=一0.0289+ 0.158X，r=0.999，說明在0.02～12.5 Ixg·mL 范 圍內原兒茶醛與內標的峰面積比(A樣品／A內標)與其血 漿濃度線性關系良好，其最低定量限為20 ng·mL一1 o

 2.6.4回收率按“精密度”方法，計算測得量，用 測得量與加入量計算回收率，結果見表2。

 2.7胎羊血漿藥物濃度的測定及結果將備用的血漿 37。(=溶解后，按“樣品測定方法”測定，母羊靜注 200，400，800 mg丹參粉針劑后胎羊血漿中原兒茶醛的濃度結果見表3，相應的平均藥一時曲線見圖 2。結果表明，于0.083，0.5，1.5 h，3個劑量組均 測得胎羊血漿中含有原兒茶醛，且隨著給藥劑量的增 加，血藥濃度呈上升的趨勢，具有一定的相關性。原 兒茶醛在胎羊體內很快吸收，達峰時間0.083 h，而 后以較快速度消除。2 h后，未測到原兒茶醛。

 由于中藥制劑成分復雜，被測成分含量較低， 而胎羊體內濃度更低，給研究帶來一定難度。本文 以原兒茶醛為檢測指標， 以卡馬西平為內標，用 HPLC法測定胎羊血漿中的原兒茶醛濃度，方法簡 便可行。丹參制劑在妊娠期的研究已有很多，但多 限于機理探討和臨床應用 。本研究通過測定胎 羊血漿中原兒茶醛的濃度，明確了丹參制劑中原兒 茶醛可以通過胎盤屏障進入胎羊體內的，而且給藥 劑量與胎羊的血藥濃度具有一定相關性，但是否對 胎兒造成影響，尚需對丹參制劑的安全性作進一步研究。