紅四氮唑作為電化學嵌合劑的核酸雜交生物傳感器

1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
        CHI 660A型電化學工作站(上海辰華儀器廠，SYZ-A 型石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇省金壇儀器廠，501型超級恒溫裝置(上海實驗儀器廠，88-1型磁力攪拌器(上海司樂儀器廠，232 型飽和甘汞電極(3mol/L KCl)，鉑絲對電極。兩條含有23個堿基互補的單鏈DNA片段 5’-NH2-CCAAATGCAGGACAAATGCAACC-3’，ss-DNA(1)，和5’-GGTTGCATTTGTCCTGCATTTGG-3’，ss-DNA(2) (浙江大學生物研究所)，紅四氮唑(上海前進試劑廠)，羥基丁二酰亞胺(NHS)及乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，AldriCh公司)，小牛胸腺DNA(上海化學試劑公司)，魚精子 DNA(上海長陽制藥廠)，0.2 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 磷酸鹽緩沖液。水為二次蒸餾水，所有試劑均為分析純。

1.2 實驗方法
1.2.1 單鏈DNA片段在石墨電極上的固定
        將自制浸蠟石墨電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極(3mol/L KCl)鉑絲為對電極，將三電極浸入到體積分數為2.5%的K2Cr2O7 和10%的HNO3溶液中，在恒電位(+1.5V)下氧化30s。將電極清洗后浸入含有1×10-3mol/L EDC 和1×10-2mol/L NHS的磷酸鹽緩沖液(pH=6. 8)中，于60°C下加熱活化10min。將 10μL 1×10-5mol/L ss-DNA(1)及pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液滴在電極表面后，自然晾干，洗凈備用。

1.2.2 雜交過程
        以1mL 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液為底液，在雜交池中加入含有一定濃度的ssDNA(2)和NaCl溶液各10mL.。將上述固定好ssDNA(1)的電極插入雜交池中。在 60°C及+0.5V恒定電壓下雜交50min。然后用體積分數為0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)和磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極15min，除去未雜交的單鏈DNA。

1.2.3 紅四氮唑嵌合
        將上述雜交好的石墨電極浸入一定濃度的紅四氮唑的磷酸鹽緩沖溶液中(pH=7.0)，均勻攪拌嵌合2min，嵌合完畢后用重蒸水清洗電極，除去附著在電極上的紅四氮唑。

1.2.4 電化學測定
        將嵌合好的DNA石墨電極作為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極，以 0.2 mol/L pH 值為7.0 的磷酸鹽緩沖溶液為底液進行伏安掃描。掃描電位在-0.3~-1.0V范圍內，記錄嵌入DNA分子雙螺旋結構中的試劑所產生的還原電流，根據峰電流大小測定 DNA 含量。

參考文獻
程瓊, 彭圖治. 紅四氮唑作為電化學嵌合劑的核酸雜交生物傳感器. 高等學校化學學報, 2002, 23, 1680-1683.